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數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展和原理

更新時(shí)間:2021-08-27

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 在定量PCR時(shí),我們常常糾結(jié)一個(gè)問題,究竟是相對(duì)定量還是定量呢?如今,你無需糾結(jié)了,因?yàn)閿?shù)字PCR(digitalPCR)來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似,都是估計(jì)起始樣品中的核酸量,但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測(cè)定核酸量,而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù),是對(duì)起始樣品的定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域:拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。[1-2]
  技術(shù)發(fā)展
  20世紀(jì)末,Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digitalPCR,dPCR)的概念,通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應(yīng)單元,每個(gè)單元至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板),在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。[1][3]
  數(shù)字PCR是一種核酸分子定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法,光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值,Ct值就是指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù);數(shù)字PCR是的定量技術(shù),基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量,是一種定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法,將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中,每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后,有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào),沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積,就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
  原理
  PCR實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下,DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng),擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。
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